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共沉淀法是什么|原理圖（共沉淀法的優缺點及方法有哪些）

標簽：添加時間：2022-11-23 瀏覽次數:4024

　　共沉淀法是什么|原理圖（共沉淀法的優缺點及方法有哪些）

　　生物個體的許多生命活動過程都與蛋白質相互作用有密切的聯系，因此隨著生命科學研究的不斷深入，研究蛋白質相互作用成為了揭示各種生命活動機制的必要步驟。迄今已經發展出了多種用于研究蛋白質相互作用的技術和方法，例如免疫共沉淀，酵母雙雜交技術，雙分子熒光互補技術，熒光共振能量轉移技術和串聯親和純化聯合質譜分析的方法等。

　　Co-IP是一種基于抗原與抗體的專一性結合的實驗方法，廣泛應用于檢測生理條件下蛋白質與蛋白質之間的相互作用。這種方法常用于鑒定兩種目標蛋白質是否存在相互作用，也可以用于確定某種已知蛋白質和其他未知蛋白質之間的相互作用。

　　Co-IP的基本原理：首先在非變性條件下使用溫和的細胞裂解液裂解細胞，此時存在于完整細胞內的蛋白質與蛋白質之間的相互作用被保留了下來。隨后向細胞裂解液中加入偶聯某種抗體的瓊脂糖珠并進行孵育。當蛋白質A被其抗體特異識別并結合后，A可以與其抗體免疫沉淀，那么在細胞內與A存在相互作用的蛋白質或者蛋白復合物B也能沉淀下來。利用洗脫液洗脫沉淀下來的蛋白，通過Western blotting對這些蛋白進行鑒定和分析。

　　實驗方法

　　收集已同時表達蛋白X和蛋白Y的細胞。

　　吸凈細胞培養液，用PBS小心漂洗一次，然后加入500μl預冷的Lysis/IP buffer，于冰上放置15 min，每隔幾分鐘晃動一次。

　　將細胞裂解液轉移至1.5 ml EP管內，于4℃，13,000 rpm離心5 min。

　　將離心后的上清留取少量樣品后（所留樣品加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液，混合后，于100℃煮沸5 min，離心后放置-20℃保存備用），對蛋白含量進行定量，補充Lysis/IP buffer至1 ml左右，然后分別加入50μl 50％的Progein G beads，于4℃環境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉1 h以除去Protein G beads非特異結合的蛋白。

　　于4℃，13,000 rpm離心5 min，將上清液再次轉移至1.5 ml EP管內，加入1μl的正常小鼠IgG或者是FLAG單克隆抗體，于4℃環境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉1 h，使抗體與蛋白進行特異結合。

　　加入50μl 50％的Protein G beads，于4℃環境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉1 h，使Protein G beads與抗體結合。

　　于4℃，13,000 rpm離心5 min，棄上清，然后用Lysis/IP buffer洗滌三次，每次都在4℃環境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉15 min。

　　最后一次洗滌完畢，棄上清，管中只剩下beads，加入25μl的2×蛋白上樣緩沖液，混合后，于100℃煮沸5 min，離心后即可上樣SDS-PAGE膠或者放置-20℃保存備用。

　　注意事項

　　細胞裂解要采用溫和的裂解條件，避免破壞細胞內存在的蛋白間相互作用，裂解、洗滌時需使用非變性裂解液，如NP-40和Triton X-100。

　　由于不同細胞裂解條件不一樣，建議通過預實驗來確定最佳條件。

　　抗體的選擇十分重要，選經過IP驗證的抗體，可以減少假陽性概率。

　　注意抗體/緩沖液的比例，抗體稀釋過度不利于后續抗原抗體結合；而抗體過多就不能完全沉降在固相基質上，殘存于上清。

　　操作時，為了避免損傷beads，使用大口徑或截短槍頭進行加樣。

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